共有86名患者，包括32例CRC患者，16例AP患者和38个HCS在2016年1月至2019年2月在意大利Careggi医院和佛罗伦萨大学之间进行了不同的研究。伦理委员会地区Vasta Toscana Centro（意大利）批准了研究。在开始任何治疗之前，在诊断时均采集所有粪便样本（例如,手术切除，化疗，益生菌摄入量。此外，排除了患有严重疾病，免疫缺陷，自身免疫或传染病的患者。CRC患者，AP患者和HCS在年龄，性别和体重指数中均匀匹配。桌子1总结入组患者的临床特点。

粪便样本是在事先贴上标签的收集杯中收集的。将粪便水按1:2 (g/mL，未解冻的粪便与缓冲液重量)的比例在0.75 M磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.4)中提取[19］.通过旋转混合30s并超声处理15分钟的缓冲样品。然后将每个样品在4℃下以10000g离心10分钟，将700μl上清液转移至1.5ml Eppendorf管，并在4℃下以14000rpm再次离心5分钟。透明的上清液用于NMR分析。

共70 μL缓冲液(1.5 M KH₂阿宝_4./ d₂O, pH值7.4;2更易/ L NaN_3.;将0.1％TMSP加入到630μl的每个新鲜粪便水样中，并将总共600μl该混合物转移至5mM NMR管。

一维质子NMR（¹所有样品的H-NMR谱图均使用Bruker 600mhz光谱仪(Bruker BioSpin srl;(德国莱因斯坦)以600.13兆赫质子拉莫尔频率工作，并配备一个5毫米PATXI¹H-¹³C-¹⁵N和²H-解耦探头，包括aZ.轴梯度线圈，自动调谐匹配和自动和冷藏样品更换器（SampleJet，Bruker Biospin Srl; Rheinstetten）。

BTO 2000热电偶用于在样品大约0.1 K的水平上的温度稳定。测量前，样品在核磁共振探头内保持至少3分钟，以达到温度平衡。

两个一维¹H-NMR谱，即一维(1D) NOESY和carr - purcell - meiboomo - gill (CPMG)，在310 K不同脉冲序列下获得:标准核Overhauser效应谱脉冲序列1D NOESY PRESAT (noesygppr1d.comp;Bruker BioSpin)脉冲序列，使用64个扫描，98304个数据点，光谱宽度为18028 Hz，采集时间为2.7 s，松弛延迟为4 s，混合时间为0.1 s;和标准自旋回波CPMG[20.) (cpmgpr1d.comp;Bruker BioSpin)脉冲序列应用于标准1D序列，具有64个扫描，73728个数据点，光谱宽度为12019 Hz，弛豫延迟为4秒。

在应用傅立叶变换之前，将自由感应衰减乘以一个等效于0.3 Hz线展宽因子的指数函数。转化光谱自动校正相位和基线畸变，粪便光谱使用TopSpin版本4.1.0 (Bruker BioSpin GmbH)校准到0 ppm的TMSP单线态。

NMR光谱在0.2 ~ 10.00 ppm的光谱范围内被分割成0.02 ppm的bins。含有残留水信号的区域(在4.6和4.9 ppm之间)被从仓中去除。使用Assure NMR 2.2对每个箱子内的光谱强度进行集成，并计算相应的面积，得到作为统计方法输入的变量。

在分析生成的数据矩阵之前，概率的商归一化[21对变量进行归一化和均值居中处理。

数据的统计分析使用R[22］.在加工的NMR光谱上，进行多变量数据分析。主要成分分析（PCA）用作无监督的技术，用于探索性分析，以检查所获得的光谱的均匀性，并显示异常值的存在。作为一种监督技术，应用了潜在结构的正交突起 - 施加判别分析（OPLS-DA）。OPLS-DA方法是多变量投影方法，通常用于模拟光谱数据。与PCA或部分最小二乘投影相比潜在结构（PLS），OPL能够区分数据中的“响应相关”和“响应 - 正交”波动，从模型解释方面提供益处[23］.所有报告的准确性和不同分类的混淆矩阵通过100个周期的蒙特卡罗交叉验证方案(MCCV，内部开发的R脚本)进行评估。在这种情况下，在每次迭代中随机选择90%的数据作为构建模型的训练集。然后检测剩下的10%，并评估分类的敏感性、特异性和准确性。代谢物鉴定是根据以往文献手工进行的[19那24]、人类代谢组数据库公共数据库、纯有机化合物库(BBIOREFCODE;力量BioSpin)。计算相对代谢物浓度(以任意单位表示)，积分并计算峰面积[25］.

为了确定被研究的所有类别之间的鉴别分子，选择Wilcoxon检验来推断两组受试者之间的差异[26］.使用Benjamini＆Hochberg方法应用假发现率（FDR）校正，并调整P.< 0.05被认为有统计学意义[27］.效果大小，使用克利夫的三角洲(Cd)公式[28，以帮助识别有意义的信号，从而估计不同组之间的距离大小。使用Romano和Coll中提供的阈值评估震级[29]，即。|Cd| < 0.147”可忽略，“|Cd| < 0.33”小，“|Cd| < 0.474”中，否则为“大”。

以代谢物水平的变化为日志₂两组频谱中对应信号的归一化中位数强度之比。途径分析使用MetaboAnalyst 4.0免费在线软件[30.］.

获得86份粪便提取物(32 CRC, 16 AP, 38 HC)的核磁共振谱。由于7个光谱的匀波质量不佳，只有79个光谱(1D NOESY: 26 CRC, 15 AP和38 hc;CPMG: 27 CRC, 14 AP, 38 hc)用于后续分析。

PCA最初是使用粪便提取物的桶状光谱来生成不同组患者(CRC、AP和hc)之间变异的概述。如图所示，在前两个主成分的得分图中可以检测到一些趋势补充图1．的确，两个评分图都显示CRC和AP患者组比分组较多的hc患者组更倾向于在图中扩散。然而，在使用这种无监督方法的患者组的代谢组学谱中似乎没有出现净聚类，就hc而言也是如此。

已经进行了组中的比较分析以测试该群体的能力¹利用H-NMR粪便水谱对患者的样本进行诊断分类。使用MC交叉验证监督OPLS-DA方法建立了几个模型。首先，所有三组(CRC、AP和hc)在同一模型中使用，以检验该方法预测健康或病理的准确性使用单桶核磁共振粪便光谱(补充图2.）。如在分数图中所示补充图2.， AP样品占据hc和CRC之间的中间代谢组空间。实际上，OPLS-DA NOESY和CPMG模型的ap阳性真实百分比分别为37.7%和18% (补充图2.），大多数AP患者在HCS或CRC的代谢形式内被错误分类。

由于无法获得患者的预后数据，因此无法评估在结直肠癌代谢组空间内预测的AP患者是否更容易发生癌症。

正确分类HCS的能力为临床筛查提供了另一个重要挑战。实际上，与AP + CRC患者相比，已经尝试将HCS的粪便水谱区分开，使用1D Noesy Binned Spectra（表2那supmentary图3）。

此外，建立了分离模型，分别比较¹HNMR垃圾谱的HCSvsCRC,高碳钢vsAP和CRCvsAP患者（表2那补充图3B-D）。如表所报告的那样2，所有建立在1D NOESY桶形谱上的模型都比建立在CPMG谱上的模型性能更好。补充图3.显示了表中所列模型中较高预测精度相关的得分图2．报道的模型表明，与hc相比，CRC和AP的粪便提取物中存在代谢组学指纹，证实了PCA之前和现有文献的建议[24那31-33］.

在大多数生物流体中，低质量代谢物与高质量生物分子（如脂质，蛋白质和脂蛋白）共存。这里，使用两种NMR脉冲序列来选择性地观察不同的组分：1D噬菌体脉冲序列产生频谱，其中代谢物和高分子量分子的信号（如。如脂质、脂蛋白和白蛋白);CPMG脉冲序列可选择性地观察含有大分子(通过T2过滤)。代表一维¹用上述脉冲序列获得的粪便提取物的核磁共振氢谱如图所示补充图4.．实际上，对低分子量和高分子量化合物敏感的Noesy实验导致本研究中考虑的所有病例的更准确的分类器，并在表中描述2（HCS.vsAP与CRC:敏感性84.9%，特异性85.7%，预测准确性85.3%;高碳钢vsCRC:敏感性85.0%，特异性88.6%，准确性86.8%;高碳钢vsAP:敏感性71.7.8%，特异性83.8%，预测准确性77.8%:APvsCRC：敏感性87.4％，特异性71.6％，预测精度为79.5％）。

目的是鉴定每组的代谢物水平变化特征，将单变量分析应用于鉴定的粪便代谢物。在CRC患者和HCS之间的粪便样本的代谢谱中观察到标记的变化。实际上，首先的是3-羟基苯乙酸酯，甲醇，半乳糖，乙酸酯，木糖和异丁酸酯的显着较低含量和甘油和苯丙烯含量较高的含量（图1）。与HCs相比，AP患者的3-羟基苯乙酸酯，丁酸酯，乙酸酯，丙酸盐，异丁酸酯和乳酸+苏氨酸（由于1.33ppm的重叠的双峰相同），如图所示1 c．在CRC粪便提取物专业文件，与AP患者相比，只有亮氨酸，酪氨酸和缬氨酸仍然是STA具有统计学意义，且存在较高的数量(图1 b）。鉴定的粪便提取物代谢物的完整列表补充表1．鉴定的最相关的途径在表中报告3.和补充图5.．

图1大肠癌、息肉患者和健康对照组的粪便水代谢物水平 用于显着改变的代谢物的折叠变化（FC）值的Boxplots。红条代表伪发现率（FDR）校正后仍然显着的代谢物水平（FDRP.< 0.05)，绿色条是FDR校正后不再显著的代谢物(P.< 0.05)。在比较中也报告了每种代谢物的Cliff的delta效应大小(a:小效应，b:中效应，c:大效应)。A:健康对照组(hc)与结直肠癌(CRC)患者的比较，负对数₂(FC)值表示CRC粪便样本中较低的代谢物水平，阳性对数₂(FC)值报告CRC的含量高于hc;B:负对数₂(FC)表示CRC患者的代谢产物水平高于息肉患者;C: hc与息肉患者阴性log的比较₂(FC)值表示息肉患者粪便中的代谢产物水平较低。

CRC中识别出的六大代谢途径(P.< 0.05)为氨基酰- trna生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，苯丙氨酸和半乳糖代谢和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解。其中，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、氨基酰基- trna的生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途径也在AP患者中发生改变(表)3.）。

结直肠癌(CRC)是全球第三大常见死亡原因。如果早期诊断，CRC对治疗反应良好，通常预后较好。不幸的是，尽管结肠镜检查具有侵袭性，但它代表了筛查CRC的金标准程序。

考虑到结肠镜检查是一项昂贵且有创的手术，引入具有最小侵入性、安全性和可重复性的定制方法似乎至关重要。粪便样本筛查相对于其他筛查技术有许多优点。

我们研究的主要目的是将HCS（HCS）与CRC或腺瘤性息肉（AP）患者的粪便核磁共振（NMR）代谢组分进行比较，以表征组中的变异，并可能识别一些诊断标志物。

为了定义32 CRC，16例AP患者和38 HCS的粪便代谢曲线，我们将质子核磁共振光谱与多变量和单变量统计方法结合使用。

获得了86份粪便提取物的核磁共振谱。为了确定各组的代谢物水平的变化特征，对所鉴定的粪便代谢物进行了单变量分析。最显著的变化是CRC患者粪便样本的代谢谱vs高碳钢。AP患者3-羟基栓酰乙酸、丁酸酯、乙酸酯、丙酸酯、异丁酸酯和乳酸+苏氨酸含量较hc明显降低。在CRC的粪便提取谱中，与AP患者相比，只有亮氨酸、酪氨酸和缬氨酸具有统计学意义，且含量较高。

粪便样本的代谢筛查可能有助于非侵入性筛查试验的发展。迄今为止，评估与CRC相关的粪便代谢变化的研究仍然缺乏。此外，没有研究描述与腺瘤相关的粪便代谢组学改变。CRC和AP患者的短链脂肪酸显著降低，特别是在hc中观察到较低的醋酸水平。与之前的数据相比，我们没有发现CRC患者的丁酸水平低于hc;然而，我们观察到AP患者的水平显著下降。我们发现CRC和AP患者的3-羟基苯乙酸(3-HPAA)酸水平均显著降低。最后，CRC患者的粪便中存在较多的氨基酸，如亮氨酸、酪氨酸和缬氨酸(与AP相比)，这可能是由于大的上皮细胞炎症和损伤导致吸收不良。

我们首次发现粪便样本图谱可以区分CRC患者、AP患者和hc患者，并识别出一些具有鉴别性的代谢物，包括乙酸、丁酸、丙酸、3-HPAA酸、缬氨酸、酪氨酸和亮氨酸。我们相信，我们的数据将成为未来CRC治疗研究的起点，特别是治疗效果的诊断和评估。