病例报告 开放存取
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世界临床病例杂志。 2021年10月16日; 9(29): 8797-8803
在线发布2021年10月16日。内政部:10.12998/wjcc.v9.i29.8797
专性携带者墨西哥夫妇成功妊娠丙酸血症的全基因组扩增/植入前基因检测:一例报告
Adina Neumann,Miguel Angel Alcantara-Ortiagoza,AriadnaGonzález-del Angel,Nestor AlejandroZarateDíaz,哈维尔山姆Santana,Leonardo M Porchia,EstherLópez-Bayghen
阿迪娜·诺依曼,墨西哥城因杰斯研究与诊断分子实验室,邮编:05320
Miguel Angel Alcantara-Ortigoza, Ariadna González-del Angel,墨西哥国家儿科研究所医学研究所生物分子实验室,墨西哥城04530
Miguel Angel Alcantara-Ortigoza, Ariadna González-del Angel,DNA-Gen S.C.Centro de Alta Especialidad enGenéticaMumana,墨西哥城14070,墨西哥
内斯特·亚历杭德罗·萨拉特·迪亚斯、哈维尔·萨姆·桑塔纳、,InvestigaciónClínica,Ingenbes,Puebla 72820,墨西哥
Leonardo M Porchia, Esther López-Bayghen,墨西哥墨西哥城国家科学院礼貌研究所研究中心毒理学部,邮编:07360
ORCID号码: Adina Neumann(0000-0002-2563-8540);Miguel Angel Alcantara-Ortigoza (0000-0003-0592-8214);阿里阿德娜·冈萨雷斯·德尔·安吉尔(0000-0002-7096-0969)内斯特·亚历杭德罗·扎拉特·迪亚斯(0000-0002-1904-4738);Javier Sam Santana(0000-0003-4038-3125); 莱昂纳多·M·波奇亚(0000-0002-4082-7606);埃丝特·洛佩斯·贝根(0000-0002-2849-7587).
作者捐款:该项目由Neumann A和López Bayghen E构思;数据采集由Neumann A、González del Angel A、Alcantara Ortigoza MA、Santana JS和Zarate Díaz NA执行,González del Angel A和Alcantara Ortigoza MA评估遗传数据、测序和比对,Neumann A收集基因组数据,Santana JS和Zarate D迪亚兹·娜分别作为胚胎学家和临床医生处理该病例,收集有关父母病史和体外受精数据的信息;数据分析和解释由诺依曼A、冈萨雷斯·德尔·安吉尔A和阿尔坎塔拉·奥提戈扎·马进行;诺依曼A、扎拉特·迪亚兹·娜、波契亚·LM和洛佩斯·贝根E起草了文章和标准我仔细地修改了它;所有作者都批准了手稿的最终版本。
知情同意声明:根据赫尔辛基的宣言,这两个患者都提供了书面知情同意参加本研究。书面知情同意书是从患者获得的,以便在本条中公布的匿名信息。
利益冲突声明:作者没有相关的财务或非财务利益需要披露。
护理检查表(2016)声明:作者已经阅读了CARE Checklist(2016),并根据CARE Checklist(2016)对稿件进行了编写和修改。
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相应的作者:Esther López Bayghen,博士,墨西哥圣佩德罗·扎卡坦科国家礼貌研究中心毒理学系2508,墨西哥城圣佩德罗·扎卡坦科国家礼貌研究所,Avenzados del Instituto Polite,Avenida Instituto Polite,cnico National 2508,墨西哥07360。 ebayghen@cinvestav.mx
收到:2020年12月16日
同行评议开始:2020年12月16日
第一个决定:2021年7月16日
修改:2020年7月28日
认可的:2021年9月7日
文章在新闻:2021年9月7日
网上发表:2021年10月16日

摘要
背景

由于辅助生殖机构目前的筛查方法侧重于一次检测多种遗传疾病,在健康夫妇中确定一种潜在的单基因疾病的成本很高。在这里,我们报道了一种低成本和快速的单基因/单基因缺陷(pgal - m)植入前基因检测方法的成功应用,该方法用于检测胚胎中的丙酸血症(PA),该胚胎获得了经证实的杂合子丙酰辅酶a羧化酶α亚基(PCCA)一对。

案例摘要

一对有生育能力的32岁墨西哥夫妇否认血缘关系,寻求产前遗传咨询。他们被怀疑是原发性PA携带者,原因是先前死亡的PA男性新生儿患有不明原因的PAPCCA/丙酰辅酶A羧化酶β亚单位(表示)基因型:下一代测序显示一个致病基因的杂合基因型PCCA变体(c.2041-1G > T, ClinVar: RCV000802701.1;dbSNP:rs1367867218)。这对夫妇要求在体外体外受精(IVF)和ptt - m治疗PA。通过体外受精,收集了12个卵母细胞并使其受精,其中2个产生了高质量的胚胎。通过营养外胚层切片和基于片段/扩增的方法进行全基因组扩增,发现两个胚胎是整倍体。末端聚合酶链反应和进一步的Sanger测序显示,外显子-内含子边界为野生型PCCA雄性胚胎和一个杂合的c.2041-1G>T雌性胚胎。两个胚胎都被移植,导致临床妊娠并分娩了一个健康的男性新生儿(38周,体重:4080克,长度:49厘米,APGAR 9/9)。通过扩大新生儿筛查证实了PA的缺失。

结论

我们表明,使用全基因组放大模板的PGT-M与IVF相结合,可以减少致病变种的传播PCCA基因

关键词: 丙种酸血症,常染色体隐性,丙酰辅酶a羧化酶亚基( PCCA)基因,植入前基因检测,新一代测序,胚胎移植

核心提示:丙酸血症是一种罕见的单基因疾病,可导致严重的遗传并发症和死亡。丙酰辅酶A羧化酶亚基基因致病变异的杂合子基因型(PCCA)位于一对可生育的墨西哥夫妇中。在这里,我们展示了一对夫妇可以使用在体外受精、遗传咨询和全基因组扩增模板测序。此外,在胚胎移植后,我们报告了一例无丙酸血症的健康男性新生儿的分娩。



介绍

对于有生育能力的健康夫妇来说,当疾病的特征出现时,遗传疾病的诊断就发生在出生后。然而,对于胎儿患有有害疾病的遗传性疾病,怀孕和分娩健康新生儿的概率显著降低。因此,许多高危夫妇参加辅助生殖设施进行单基因/单基因缺陷(PGT-M)植入前基因检测。然而,与PGT-M相关的成本(包括对200多种遗传疾病的评估)可能非常昂贵,而且对一些患者来说,是预防性的。因此,当成本是一个问题或该疾病不在标准PGT-M范围内时,需要替代方法。丙酸血症(PA,MIM#606054)是一种常染色体隐性、危及生命的代谢性疾病,由线粒体酶丙酰辅酶a羧化酶(PCC)缺陷引起。PCC将丙酰辅酶A羧化为甲基丙二酰辅酶A,并降低/消除PCC活性,导致丙酰辅酶A的左卡尼汀酯血浓度升高[1.].PCC由α和β亚单位组成,由PCCA(13 q32.3 MIM * 232000)表示(3Q22.3,MIM * 232050)基因分别[1.].出生后不久,大约65%的PA患者患有症状,如呕吐,嗜睡,垃圾喂养,低呼吸和其他临床数据[2.]。如果不治疗,PA可能发展为严重疾病,伴有神经、心脏、血液、肝脏和胰腺并发症或死亡[1.,2.].由于全球所有PA病例中的80%是由单核苷酸或其他小病原发生的变化引起的,这导致PCC活动的丧失[1.,2.],怀疑的载体PCCA表示致病性遗传变异将受益于PGT-M。在这里,我们报告了一种低成本、快速的PGT-M方法在从确认的杂合子获得的胚胎中成功应用于PAPCCA这对夫妇导致临床妊娠并分娩了一名健康的新生男性。

案例介绍
主要的投诉

一个32岁的健康墨西哥夫妇与被剥夺的血缘关系寻求产前遗传咨询,生下Pa男后。

现代病史

他们被怀疑是专性PA携带者,因为之前有一名足月分娩的男性(3200克),他在出生后一个月就去世了,并且呈现出PA的典型临床特征。在新生儿筛查期间,通过酰基肉碱特征(血清丙酰肉碱升高),从生物化学角度怀疑死亡新生儿中的PA诊断并通过尿液有机酸浓度升高(柠檬酸甲酯、3-羟基丙酸、2-羟基异戊酸、3-羟基丁酸、3-羟基丙酸)进一步证实。

既往病史

没有明显的过去的医学史与PA相关。

个人和家族史

父母均来自墨西哥的不同州。此外,他们没有发现任何PA的任何家族史。

体检

父母双方均未出现PA携带者的任何症状或风险因素。

实验室考试

由于父母双方之前在生殖健康或其他方面没有任何并发症,因此没有进行实验室检查。

影像学检查

未进行影像学研究。

病理检查

由于无法确认死亡新生儿的致病性PA基因型,因此父母双方都接受了下一代测序(NGS)检测PCCA表示基因。使用Qubit™Flex Flearometer(新加坡)评估从外周血样品获得的父母基因组DNA的质量。通过杂交来捕获目标,以通过Nextera Rapid Capture Exame(Illumina Inc.,San Diego,CA,美国)创建图书馆,然后在Illumina Hiseq2000 2×150平台(San Diego,Ca,Ca,United States)上测序。生物信息化管道包括使用FASTQC V0.11.8的原始输出读取的整体质量评估,使用Trimmomatic v0.35修剪适配器和低质量读取的滤波,滤波的对准使用Bowtie2软件对GRCH38人参考序列进行读取。v2.3.4.1,以及单个核苷酸变化的呼叫和注释分别与GATK和SNPEFF程序的小插入删除的检测。只有一个临床相关PCCA通过终点聚合酶链反应(PCR)的单向Sanger测序来确认基因变体(PCR)含有外显子23的250bp片段PCCA基因(图1A).使用Alamut Visual 2.14软件(SOPHIA GENETICS,洛桑,瑞士)进行注释。

图1
图1丙酰辅酶a羧化酶亚基(PCCA)基因变异。 内含子22-外显子23的边界示意图PCCA基因与预测在网上一个可能的隐匿受体位点的产生;B:基因内含子22外显子23区域的部分电泳图(仅显示前向链)PCCA基因NG_008768.1和NM_000282.3在亲本和胚胎E1中均显示了可能致病变异c.2041-1G>T的杂合子基因型。G-to-T转换预示在PCCA内含子22。野生型PCCA基因型为胚胎E2和健康对照纳入分析。Sanger测序进行了三次,用于ptt - m检测。
最终诊断

双亲均为同一致病基因的无症状杂合子PCCA基因变体(图1B), c.2041-1G > T (NM_000282.4;ClinVar: RCV000802701.1;dbSNP: rs1367867218)。根据在网上通过剪接位点查找程序(如MaxEntScan、NNSPLICE和GeneSpitter程序)的评估,包括Alamut Visual 2.14软件的剪接预测模块,该变体消除了内含子22的天然受体剪接位点和外显子23内的隐蔽受体剪接位点的可能激活(位置c.2043和c.2044;图1A).

治疗

之后PCCA基因型鉴定和基因检测后咨询,父母双方都要求对PA使用PGT-M,同时对非整倍体(PGT-A)使用PGT。单人间在体外如前所述,根据Ingenes研究所的标准方案进行受精(IVF)周期、胚胎活检和PGT[3.,4.].母亲接受了一个标准疗程的控制性卵巢刺激,使用1650 UI的性腺(FSH,默克,达姆施塔特,德国)和375 UI的Merapur(Hmg Ferring Laboratories,Saint Prex,Switzerland)。36小时后,12个卵母细胞(10个处于中期II)在超声引导下取回,并通过卵胞浆内单精子注射进行受精。根据伊斯坦布尔共识研讨会的胚胎评估标准,仅考虑形态最佳的胚胎进行PGT[3.].

在胚胎发育的第5天,两个胚胎被确定为高质量胚胎并进行了活检。使用显微操作,从滋养外胚层分离出4-7个细胞,并将其置于0.2 mL PCR管中。然后,使用玻璃化冷冻技术对胚胎进行冷冻保存[4.].活检采用SurePlex DNA扩增系统(Illumina Inc., San Diego, CA, usa)进行全基因组扩增(WGA,根据制造商的协议)。进行了NGS (Veri-seq PGS Library Prep kit, Illumina Inc., San Diego, CA, usa),获得了胚胎倍性评估[4.].来确定胚胎的PCCA基因型,一式三份,对WGA-DNA样品进行PCR扩增阳离子和桑格测序分析,之前用于双亲。来自健康成人和空白对照的样本包括在所有PCR和桑格测序分析中。通过PGT-a发现获得的两个胚胎具有正常的染色体组成,并具有整倍体特征。对于PA的PGT-M,第一个胚胎(E1),具有正常的XX性染色体组成,是致病基因的杂合子PCCA变异株(NG_008768.1(NM_000282.3):c.2041-1G>T)被诊断为未受影响的女性PA携带者(图1B).第二胚胎(E2)具有正常的XY性染色体组成,为野生型PCCA并被诊断为未受影响的男性(图1B).在父母双方同意后,这两个胚胎被确定为可以移植。胚胎植入方案包括Evorel 50和Gonapeptil库(Ferring Laboratories, st - prex, Switzerland)子宫内膜制备。用Utrogestan进行黄体期支持(300 mg/天/阴道)。

结果和后续行动

转移后14天,β-hCG血清水平为168.0 mUI/mL,证实为阳性妊娠。16周后,超声波显示为单个妊娠囊。这对夫妇拒绝确认PCCA胎儿基因型的侵袭性诊断试验。在第11-13周进行了双重测试,这表明在第1周发生染色体病的风险较低三个月。同时,进行了TORCH筛检,结果为阴性。结构超声和五次后续咨询显示,婴儿在整个怀孕期间都是健康的。一名健康男婴在妊娠38周后出生(体重4080克,体长49厘米,APGAR 9/9)。新生儿的代谢筛查显示酰基肉碱水平正常。此外,在出生后的几天内没有发现PA的典型症状。当提交这篇文章时,孩子4个月大,没有出现任何PA症状。

讨论

在这里,我们报道了一对夫妇,他们接受了孕前咨询,基因检测前和后咨询,进行试管受精和ptt - m,以避免产生受影响的PA后代的高概率。预防性生殖方法取得了成功,这对夫妇能够怀上一个健康的新生儿。与其他可能致命的有机酸血症的报道一样,PA的不良临床预后证明,有必要向高危夫妇提供孕前遗传咨询和预防性生殖选择,如ptt - m [5.].据估计,约0.36%的新生儿出现单基因疾病[6.].这些孟德尔病可以通过PGT在风险夫妇的胚胎中鉴定。目前,有不同的技术可以直接搜索特定的突变,从而对潜在胚胎进行高度精确的遗传诊断。PGT-M已经对234个致病基因变异进行了测序验证;然而,这种方法增加了完成任务的成本和时间。正如之前指出的,应用于PGT-M的NGS策略允许识别位于整个基因组的致病变异,包括那些导致“罕见疾病”的变异,如有机酸血症[5.]然而,这种方法是一种昂贵且耗时的检测方法,对于先前已确定特定致病基因型的夫妇来说,似乎不是一种负担得起的选择。因此,最直接的方法是进行PGT-M鉴定体外受精产生的整倍体胚胎的致病基因型[4.].事实上,在这里,我们的技术提出了一个替代产前诊断,避免终止妊娠的情况下,有缺陷的胎儿。此外,与此提出的方法相关的成本可以显著减少患者的费用,使测试更容易获得。

对于胚胎活组织检查,如果DNA不足或浓度很低,分析过程中可能会出现重大问题。可以通过执行WGA来改善信号。我们之前已经证明,使用基于片段化/扩增的方法获得的WGA-DNA,可以产生合适的DNA模板,用于产生小PCR片段(250 bp的aprox)。这些片段通过简单的自动化Sanger方法成功测序,以快速确定单核苷酸变化或其他小致病性变体的特定胚胎基因型[4.].然而,由于等位基因辍学现象,这种测定必须考虑假的积极可能性。如在最近报道的pGT-M中,通过等温基因组扩增获得的WGA-DNA模板进行了[4.]在我们的三份Sanger测序测定中,我们无法记录等位基因辍学现象。当PGT-M基于通过基于碎裂/扩增的方法获得的WGA-DNA时,需要进行进一步的验证研究以量化等位基因扩增失调的可能性。

亚太地区、欧洲和北美的PA出生流行率分别为每100000名新生儿0.29、0.33和0.33[7.但是,在墨西哥仍然是未知的。对于墨西哥人群来说,这种疾病似乎非常罕见,由应用丙氨酸谱的至少两种扩大的新生儿筛查报告确定[8.9],尽管PA在墨西哥患者中所检测到的中间代谢先天性错误中约占7% [10].迄今为止,在人类基因突变数据库中(http://www.hgmd.cf.ac.uk/),大约有25个剪接缺陷与PA有关。据我们所知,文献中没有报道c.2041-1G>T变异与PA相关。然而,根据gnomAD数据库,它被列为极不常见的等位基因,在拉丁美洲人群中只有单一杂合个体(等位基因频率0.00002891)。这一特征与这对夫妇否认的血缘关系形成对比。有趣的是,父母双方都是墨西哥血统。然而,他们来自墨西哥的不同州,支持这对夫妇没有内婚制的状态。

最近,ClinVar数据库中报告了c.2041-1G>T变异体作为一种可能的致病变异体(RCV00802701.1),因为它预测会使对基因天然受体剪接位点的识别无效PCCA内含子22。另一种致病性变体,c.2041-2A>G,影响相同的受体剪接位点,调节mRNA中外显子23的跳跃,但导致成纤维细胞中具有高残留PCC活性的相对温和的PA表型。这归因于产生少量正常剪接的转录本[11]。如果c.2041-1G>T变异体也导致外显子23跳过,则产生的蛋白质将失去生物素结合基序,导致非功能性PCC酶[11].必须通过进一步的实验分析来确定c.2041-1G>T的确切致病作用及其可能的基因型-表型相关性,从而确认外显子23内可能残留的外显子23保留和预测的框外隐匿受体剪接位点的激活。

结论

在这里,我们报道了c.2041-1G>T变异PCCA基因分类为可能致病,并与PA有关。此外,我们的研究表明,使用ptt - m结合体外受精可以避免PA在患者后代中的传播,这将减少不成功妊娠的可能性,并增加生下健康婴儿的可能性。最后,我们证明了使用WGA-DNA模板作为一种低成本、快速、准确的ptt - m治疗危及生命的疾病(如PA)的可行性。

致谢

我们非常感谢本次研究的参与者和荷兰国际集团。感谢卢塞罗·塞万提斯·波佐斯的编辑协助。我们也感谢Semper Genomics SA de CV的技术支持。

脚注

原稿来源:自荐原稿

通讯作者在专业协会的成员:美国生殖医学学会;美国神经化学学会,第12657号;神经科学学会,第100008912号。

专业类型:生殖生物学

原产国/地区:墨西哥

同行评审报告的科学质量分类

A级(优秀):A

B级(非常好):0

丙级(良好):0

d级(公平):0

E级(差):0

p -评论员:Kim HS s -编辑:Zhang H -编辑:A p -编辑:Li JH

参考文献
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